【摘要】 目的 探讨充血性心力衰竭（Congestive Heart lailure CHF）患者外周血辅助性T淋巴细胞功能失调及其在心力衰竭发生及发展中的意义。方法 选择62例充血性心力衰竭患者作为实验组，并按照纽约心脏病协会（NYHA）分为心功能Ⅱ级（28例），心功能Ⅲ级（16例），心功能Ⅳ级（18例），另选30例健康志愿者作为对照组。采用流式细胞分析法，检测所有被检者外周血CD4 细胞胞内细胞因子干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）的表达。同时分离外周血单核细胞（PBMC），经植物血凝素（PHA）刺激培养后，应用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测培养上清液中IFN-γ和IL-4水平。结果 充血性心力衰竭组患者IFN-γ染色阳性的细胞占CD4 T细胞的比率为17.48%，明显高于对照组的12.09% 。IL-4染色阳性细胞比率在两组间未见显著统计学差异。ELISA检测显示心力衰竭组培养上清液中IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值明显高于对照组，而两组间IL-4水平则无显著统计学意义。结论 心力衰竭患者辅助性T淋巴细胞功能与心功能之间有一定关系，且与心功能级别呈正相关。辅助性T淋巴细胞功能失调可能参与了CHF患者的心室重构过程。 【关键词】 心力衰竭；T淋巴细胞；细胞因子；干扰素γ；白细胞介素4 The investigation of cell-mediated immunity function imbalance in patients with congestive heart failure 【Abstract】 Objective To explore the significance of cell-mediated immunity function imbalance in patients with congestive heart failure.Methods Six-two patients with congestive heart failure were included and divided into 3 groups according to the New York Heart Association (NYHA),thirty healthy men were studied as control. The heart function was evaluated by two-dimensional echocardiography. Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were collected from these patients.Cytokine-producing CD4＋ T cells were quantified by 3-color flow cytometry after bring stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) and ionomyccin. After being stimulated with PHA, the levels of IFN-γ and IL-4 in culture supernatants were measured by ELISA.Results The frequencies of IFN-γ-producing T cells were found to be significantly higher in congestive heart failure group(17.48%) than that in control group(12.09%). There was no significant difference on the frequencies of IL-4-producing peripheral T-lymphocytes between the two groups. The IFN-γ level and the ratios of IFN-γ/IL-4 in congestive heart failure group were significantly higher than that of control. While there was no significant difference in IL-4 level between the two groups.Conclusion The cell-mediated immunity function was associated with heart function in patients with congestive heart failure. The up-regulation of T cell function was consistent with poor heart function, suggesting that cell-mediated immunity function imbalance may participate in ventricular remodeling after heart failure. 【Key words】 heart failure;T-lymphocytes;cytokines;interferon-gamma;interleukin-4 随着人口老龄化，高血压及冠心病等心血管疾病急性病死率显著降低，作为大多数心血管疾病的最终转归-充血性心力衰竭 (Congestive heart failure, CHF)日益成为严重威胁人类健康的重大公共卫生问题。积极探讨CHF的发生发展机制 ,可为CHF的防治提供强有力的理论指导。在过去的30年中，由于心力衰竭治疗学的深入进展，心力衰竭的病死率虽已明显下降；但仍有资料显示，心力衰竭的发病率仍未得到有效控制，CHF患者在心血管疾病入院治疗的比率中仍占到1/4以上［1］。最近的研究证实，受损的心脏可以释放或暴露正常隐蔽的抗原成分，从而触发针对心肌细胞的自身免疫应答反应，导致心室重构和心肌进一步损伤。辅助性T淋巴细胞功能失衡被认为与自身免疫性疾病的发病有密切关系［2］。本研究通过对CHF患者外周血辅助性T淋巴细胞功能检测，探讨辅助性T淋巴细胞功能失调在CHF发生与发展过程中的作用。 1 资料与方法 1.1 研究对象 收集自2004年1月～2005年10月在我院住院的CHF患者62例，其中男44例，平均年龄（62.43±2.8）岁，女18例，平均年龄（58.32±8.4）岁；按美国纽约心脏学会（NYHA）心功能分级标准，Ⅱ级28例，Ⅲ级16例，Ⅳ18例；其中冠心病38例，风湿性心脏病18例，扩张性心肌病6例。均无急慢性感染、免疫系统疾病、恶性肿瘤、风湿活动及半年内急性心肌梗死。各级心力衰竭组年龄、性别、病种比较差异无显著性。对照组：选择性别、年龄与实验组相匹配的健康人30例，男18例，女12例，年龄(56.3±6.8)岁。均为经询问病史、体格检查及常规辅助检查排除器质性疾患的健康人。 有以下情况均剔除：合并脑卒中、严重的肝肾功能不全者；周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者；恶性肿瘤患者和风湿性疾病患者。此外，合并感染性疾病如：败血症、严重的上呼吸道感染、肺部或肝胆道感染等、高热以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等均予以剔除。 1.2 研究方法 1.2.1 标本收集 每例CHF患者于住院后静脉采血5ml，2ml用于流式检测，3ml用于细胞培养，肝素钠抗凝。 1.2.2 流式细胞内细胞因子检测 取两只试管，分别为测定管和阴性对照管。每管加入肝素抗凝全血100μl和RPML-1640培养基础100μl。加入刺激剂佛波乙醇酯（PMA）25ng，离子霉素(ionomycin)1μg和蛋白质转运抑制剂莫能霉素(monensin)4μl。37℃5%二氧化碳培养箱5h。混匀，各取100μl。均加入5PE-cy5标记的鼠抗人CD4＋单抗。4℃避光孵育20min。加1ml溶血素裂解红细胞，室温10min，离心弃上清，PBS洗涤1次。加入500μl破膜剂进行细胞打孔利于细胞因子单抗进入细胞，离心弃上清后进行胞内细胞因子染色。测定管中加入5μl FITC标记的IFN-γ/PE标记的IL-4单抗，对照管加入相应的荧光标记对照抗体，4℃避光孵育20min,PBS洗涤一次后上机检测。上述主要试剂均购自BD公司。应用流式细胞仪FACSCALIBUR型。根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，对第一通道和第二通道分别以相应的同种型IgG染色细胞为阴性对照，设置各通道之间的荧光补偿后，对CD4 细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4进行检测。 1.2.3 酶联免疫吸附方法（ELISA）细胞因子检测 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,用含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞浓度为1.5×106/ml，加入植物血凝素（PHA）100mg/L,37℃,5%CO2培养箱培养48h后，收集上清储存于－20℃用于细胞因子检测。采用ELISA方法，所用操作步骤均按照说明书进行。干扰素γ（IFN-γ）和白介素4（IL－4）检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司，IFN-γ最低检测值15.625ng/L,IL-4最低检测值8ng/L。 1.3 统计学方法 所有资料均以(x±s)表示，应用SPSS 11.0软件进行统计学分析。作方差齐性检验（levene检验），方差分析（F检验），多个均数间的两两比较用q检验，以P＜0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 两组患者临床资料的比较 对照组和CHF组患者的年龄、性别和冠心病危险因素差异均无统计学意义。其中对照组男18例，女12例，合并高血压9例，合并高脂血症7例。心力衰竭组男44例，女18例，合并高血压31例，合并高脂血症16例，合并糖尿病9例。CHF患者与对照组临床资料的比较见表1。 表1 CHF患者与对照组临床资料的比较 (略)注：与对照组比较，*P＞0.05；TC：总胆固醇；LDL－C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL－C：高密度脂蛋白胆固醇；TG：甘油三酯 2.2 CHF患者与对照组心功能指标的比较 与对照组相比，心力衰竭组患者出现明显的左室扩张和收缩功能受损（表2），表现为左室舒张末期直径（LVEDd）明显增大，左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）显著降低。 表2 CHF患者与对照组心功能的比较 (略)注：与正常对照组比较，*P＜0.05 2.3 CHF组与对照组CD4＋细胞胞内因子的表达 二者的差别见表3。 表3 CHF组与对照组CD4＋细胞（略）注：与正常对照组比较，*P＜0.05 与对照组比较，CHF组患者的IFN－γ染色阳性的细胞占CD4＋细胞的比例明显增高，而IL-4染色阳性细胞比例在两组间差异无统计学意义。 2.4 CHF组与对照组PBMC培养上清液中IFN-γ及IL-4浓度差别 见表4。 表4 CHF组与对照组PBMC培养（略）注：与正常对照组比较，* P＜0.05 与对照组比较，CHF组患者的PBMC培养上清液中Th1型细胞因子-IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值明显增高，而Th2型细胞因子IL-4水平在两组间差异无统计学意义。 | 
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