关键词：细胞

【摘要】 目的 了解体外培养成骨细胞的接种数量对钙化结节形成的影响。方法 实验选用了1×105个/ml、2×105个/ml、5×105个/ml三个不同的细胞接种浓度，并且每个浓度组分别给予含β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液以及常规培养液进行细胞培养。显微镜观察钙化结节的形成，并做钙化结节染色。结果 在培养30天内，条件培养液或常规培养液培养的5×105个/ml组细胞无结节形成；而2×105个/ml组和1×105个/ml组都有钙化结节形成，而且有细胞越少形成结节越早，数量越多的趋势；给予条件培养液又较常规培养液培养有结节形成早而多的趋势。钙化结节染色显示结节为红色。结论 体外培养成骨细胞钙化结节的形成须接种适宜的细胞数量，用条件培养液培养细胞能促进钙化结节形成。 【关键词】 成骨细胞； 钙化结节； 体外培养 Observation of cultured osteoblasts forming mineralization nodes in vitro 【Abstract】 Objective To investigate whether osteoblasts cultured in vitro can form mineralization nodes. Method The osteoblasts at 1×105/ml,2×105/ml and 5×105 /ml cell density were cultured in the DMEM medium and in the DMEM medium supplemented with β-glycerophosphate sodium and ascorbic acid. The formation process of mineralization nodes were observed with microscope and calcified nodules stain was made. Results There were more mineralization nodes to form in shorter time in the 1×105/ml cell density group compared with in the 2×105/ml cell density group, but in the 5×105/ml cell density group, there were not, and with the DMEM medium contained β-glycerophosphate sodium and ascorbic acid, mineralization nodes formed more early compared with the DMEM medium. Mineralization nodes stain showed red.Conclusion Cultured osteoblasts at suitable cell density can easily form mineralization nodes in vitro, and β-glycerophosphate sodium and ascorbic acid just promote formation of mineralization nodes. 【Key words】 osteoblast; mineralization nodes; in vitro 随着成骨细胞体外培养技术的发展，其体外培养成为骨组织工程及骨替代材料研究的一种重要手段。成骨细胞的体外钙化对提取的成骨细胞鉴定及其在材料表面的生物学效应的研究尤为重要，经观察发现成骨细胞的接种数量对其钙化有影响, 而国内外文献未见关于这方面的报道。因此，有必要对成骨细胞体外钙化形成条件作以报道，为骨替代材料的研究提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料与主要试剂 日本大耳白幼兔，出生10～15天，由中国预防医学科学院提供。常规DMEM培养液内含DMEM培养基（Gibco），10% 胎牛血清（Hycolon）， 100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素。条件DMEM培养液为常规DMEM培养液中补加10mmol/L β-甘油磷酸钠和50μg/ml维生素C。 1.2 兔成骨细胞体外分离与培养 以幼兔的颅盖骨为材料，采用组织块法［1］分离提取原代成骨细胞，置于37℃, 5%CO2培养箱中培养，细胞生长至100％融合后，进行传代培养并反复纯化。 1.3 钙化结节标本制备 取第六代成骨细胞接种于置有盖玻片的六孔板内, 按细胞浓度为1×105/ml、2×105/ml、5×105/ml设为A、B、C组，每组又分两组，即A1、A2、B1、B2、C1、C2组，放入培养箱中培养。待细胞贴壁后，A1、B1、C1　组换条件培养液，而A2、B2、C2组仍为等体积的常规培养液。各组每3天换液1次，连续培养30天，显微镜观察钙化结节形成过程。 1.4 茜素红染色 镜下可见黑色不透明区域时行茜素红染色， 取出盖玻片，PBS冲洗后，95%乙醇固定10min，0.1%茜素红染色30min，蒸馏水冲洗, 甘油明胶封片。 2 结果 钙化结节形成：细胞连续培养30天，A1、A2、B1、B2组都在不同的时间内出现了肉眼可见的白色结节，显微镜下呈现黑色， 随着培养时间的延长，结节数量逐渐增多；而C1、C2组培养30天无结节形成。A1组约18天左右有结节形成；A2组和B1组约在23天左右可见有结节形成；B2组结节形成最晚约30天。观察还发现1×105个/ml组与2×105个/ml组相比较， 前者较后者有结节数量多的趋势；同一细胞接种浓度给予条件培养液培养又较常规培养液培养有结节形成多的趋势。各组在镜下观察有结节形成时行茜素红染色,结节呈现红色。

普遍认为体外培养成骨细胞经连续培养后可形成钙化结节。钙化结节的形成过程大致经过成骨细胞快速增殖期、细胞外基质成熟期、基质矿化期3个生长阶段。只有成骨细胞进入成熟期，才预示钙化发生［1～4］。本实验经观察发现体外培养成骨细胞不经传代,连续培养会停止增殖而进入下一期,但由于成骨细胞的接种数量不同,在矿化期显示出差异, 细胞接种数量越多，钙化结节形成越少甚至无 各组细胞在有结节形成时茜素红染色显示出明显的红色结节，而无结节部位的细胞为浅红色。说明各组细胞表面都有含钙基质，可见细胞具有较高分泌ALP的活性。碱性磷酸酶的表达，被认为是细胞外基质成熟期的早期标志［1］。因而说明无结节部位的细胞已进入分化期，但未达成熟。可能只有细胞局部聚集形成细胞团，才能为钙化结节的形成打下基础,同时成骨细胞之间才能相互促进成熟，胞体变小，转变为骨细胞,并随着钙化基质的增多而逐渐被埋入其内,最终形成明显的钙化结节。而细胞接种数量越多，经细胞增殖期后细胞就越多，这可能影响了细胞团的形成，导致细胞进入成熟期的时间延长,最终在一定的时间内形成的钙化结节越少甚至无。从钙化的主要机理可知，条件培养基中的β-甘油磷酸钠能为细胞提供磷酸根成分，促进生理钙盐沉积；维生素C可促进体外成骨细胞合成Ⅰ型胶原，以及胶原纤维的羟化［5］。因此，用条件培养液培养成骨细胞能为钙化提供物质基础，因而促进钙化较早发生,且结节形成也会较用常规培养液多。因此，体外培养成骨细胞钙化结节的形成与成骨细胞的数量有关。浓度太低，会影响细胞间的联系，从而影响细胞的生长增殖；浓度太高，细胞增殖太多，钙化不易发生。在有关成骨细胞钙化的研究中要注意成骨细胞的接种数量。

【参考文献】

1 李大为,秦林林. 异黄酮类药Genistein 对原代培养细胞大鼠成骨细胞增殖、分化、钙含量及矿化功能的影响.中华骨质疏松杂志, 2002，8(4):307-310.

2 刘忠厚. 骨质疏松学. 北京:科学出版社,1998，87-90.

3 Errico JA，Macneil RL，Takata T，et al. Expression of bone associated marker by tooth root lining cells in situ and vitro. Bone，1997，20 (2):1 17－126.

4 Collignon H，Davicco MJ，Barlet JP .lsolation of cells from oxine fetal long bone and characterization of their osteoblastic activities during in vitro mineralization. Arch Physiol Biochem, 1997，105(2):158-166.

5 刘莉，常红，黄国伟，等.体外培养大鼠成骨细胞实验模型的建立.天津医科大学学报，2004，10(1):39-42.