李斌元，马 云，何淑雅，钟 南，孙春莉，闵凌峰

关键词： 脆性X综合征

【摘要】 目的 检测脆性X染色体综合征智力低下基因FMR1中（CGG）n拷贝数的多态性。方法 采用PCR结合序列胶银染法、Southern blot杂交分析法，对299条表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n拷贝数的多态性及分布频率进行了测定和验证。结果 显示其范围为20～40，高峰为28 ，PCR-序列分析银染法结果与Southern blot法结果完全一致。结论 检测了湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n拷贝数的多态性；运用PCR-序列分析胶银染法快速、直接、简便、实用，适合脆性X综合征的大规模群体筛查。

【关键词】 脆性X综合征 FMR1 （CGG）n PCR

The study of the unsteady DNA repeat located in the mentally retardant FMR1 gene of fragile X

【Abstract】 Objective To detect the polymorphism of CGG repeats located in the mentally retardant FMR1 gene of fragile X.Methods To detect and test the polymorphism and frequency of CGG repeats located in the FRAXA region come from 299 chromosome of normal hunan pupulations.Results The normal range of CGG repeats is 20-40，the mean number is 28， the data showed that the results of PCR-sequence gel silver staining was the same as those of PCR-Southern blot. Conclusion Realize the polymorphism of CGG repeats located in the FRAXA locus;2. The PCR-Sequence gel silver staining was more rapid，immediate， simple and economy ，which suits to the colony screening fragile X syndrome on a large scale.

【Key words】 fragile X syndrome FMR1 CGG repeats PCR

脆性X综合征（fragile X syndrome，FraX）是常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率仅次于唐氏综合征。在人群中男性的发病率约为1/4000［1］，女性的发病率为1/2500［2］。其在细胞学上主要表现为Xq27.3带处有一细丝样的脆性位点（FRAXA）［3］，在分子水平上表现为FMR1基因5’端（CGG）n的异常扩增。（CGG）n在正常人群体中呈多态性，n=6-50，当n=50-200时为前突变，n＞200时为全突变，同时伴随其周围CpG岛异常甲基化［4］。我们根据FraX基因致病特点，通过测定湖南省人群中CGG重复序列，了解其分布的多态性，并建立一个简便、快捷的基因检测方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象及标本 208名人群为本校附属医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均36.5岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。

1.2 主要试剂 T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针PE5.1由美国纽约州立发育不全基础研究所Nanbert Zhong博士惠赠。

1.3 PCR扩增 PCR引物设计参照文献［5］，在FMR1基因内（CGG）n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为：5’-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3’，下游引物为：5’-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG -3’。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1U Taq DNA聚合酶。反应程序为：95℃预变性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

1.4 PCR产物的序列胶银染法检测 取10μl PCR产物加入载样缓冲液于6%序列胶电泳。电泳毕经乙酸固定、AgNO3溶液染色及Na2CO3显示后观察结果。

1.5 Southern印迹杂交 取5μl PCR产物于6%序列胶电泳，常规电转膜，用5′末端标记法以γ-32P-ATP标记探针PE5.1，经预杂交4h，杂交2h，充分洗膜后常规压片，-70℃放射自显影。

2 结果

2.1 湖南省人群中FRAXA位点（CGG）n的多态性及分布频率 用PCR方法分析了299条X染色体。经序列胶测定（图2），Southern印迹杂交法验证（图3），表明（CGG）n的拷贝数在20～40之间(见表1)，频率最高的为28（图1）。

图1 299条X染色体的(CGG)n多态性分布图

表1 湖南省人群中299条X染色体的CGG重复数

2.2 6%序列胶电泳检测PCR产物 见图2。

图2 6%序列胶电泳

2.3 Southern blot检测PCR产物 Southern印迹杂交结果显示PCR扩增产物区带所在位置与图2完全一致(见图3)。

图3 Southern印迹杂交

3.1 湖南省人群中FRAXA位点（CGG）n的多态性 299条M:PBR 322/MSPI;1，2，3，4，5，6分别表示CGG重复数为28，28，31，28，28，29第1，6道为正常女性，第2，3，4，5道为正常男性(下同)。

表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n测定结果显示，其拷贝数范围为20～40，高峰为28，占被检总数的64.88%。Hofstee［6］等报道的(CGG)n峰值为28，Jacobs［7］等研究发现有2个高峰，即：19～23和28～31。本文结果与文献报道基本相符，但未见到明显的终端重复数，说明选取样本有限。

3.2 PCR-序列分析胶银染法的运用 目前已有多种筛查及诊断FraX的方法，但不同方法各有其局限性。如细胞遗传学分析虽可以直接观察染色体脆性位点的病变，但此方法检出率较低；DNA连锁分析较细胞遗传学分析增加了可信度，但该技术需要有先证者，致使检测受到一定程度的限制；经典的Southern blot法虽然准确性很高，但需要用同位素来标记，给操作者带来了一定的危害，并且操作繁杂，费用昂贵，耗时长；常规的PCR法虽简便，但因无法打开CG含量高的DNA模板导致扩增失败。因此，探索出一个稳定、快速、适合大规模人群筛查FraX的方法具有重要的意义。我们通过用7-deaza-dGTP代替dGTP的改良以降低Tm值， 对299条X染色体的FRAXA位点（CGG）n进行了扩增，取得了较好的效果。检测结果显示湖南省人群的高峰为28，而且PCR序列胶银染法与PCR-Southern blot法结果完全一致。因此。该方法对FRAXA的大量群体筛查具有重要的意义。

【参考文献】

1 Turner G，Webb T，Robinson H，et al.Prevalence of fragile X syndrom.Am J Med Genet，1994，64:196-197.
2 Warren ST， Nelson DL. Advances in molecular analysis of fragile X syndrome.JAMA，1994，271(7):536-542.
3 Tommerup N，et al.Cytogenetics of the fragile site at Xq27.3 in the Fragile X S yndrome. Oxford: Oxford University Press，1989.102-135.
4 Snow K，Doud L K ，Hagerman R，et al. Analysis of a CGG sequence at the FMR-1locus in Fragile X families and in the general population〔J〕.Am J Hum Genet，1793，53:1217-1228.
5 Fu YH ，Kohl DP，Pizzuti A，et al.Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability:resolution of the Sherman Paradox.Cell，1991，67(6):1047-1058.
6 Hofstee Y， Arinami T， Hamaguchi H，et al. Comparison between the cytogenetic test for fragile X and the molecular analysis of the FMR-1gene in Japanese mentally retarded individuals.Am J Med Genet，1994，51(4):466-470.
7 Jacobs PA，Bullman H，Macpherson J，et al.Population studies of the fragile X:a molecular approach.Am J Med Genet，1993，30:454.