关键词： TrkA ChAT 基底前脑 阿尔茨海默病 雌激素

　　摘　要　酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TrkA）是神经生长因子（nerve growth factor,NGF）的功能性受体。胆碱乙酰化转移酶（choline acetyltransferase,ChAT）是胆碱能神经递质乙酰胆碱合成的关键酶。大鼠发育过程中基底前脑TrkA、ChAT表达有一定的规律，老龄鼠和早老性痴呆病人基底前脑TrkA、ChAT表达明显下调。TrkA、ChAT雌激素受体共存于基底前脑神经元。雌性激素对于大鼠基底前脑TrkA、ChAT维持正常的水平发挥作用。雌性激素替代治疗绝经后的妇女有助于减少其患阿尔茨海默病的可能性。

　　 关键词：TrkA　ChAT　基底前脑　阿尔茨海默病　雌激素

　　神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是一种经典的神经营养因子。NGF在周围神经系统（peripheral nervous system,PNS）参与交感神经元、神经嵴起源的感觉神经元的发育、存活，维持及损伤修复等作用已逐渐为人们所认识。八十年以后，人们发现NGF对中枢神经系统（certral nervous system,CNS）中基底前脑（basal forebrain）胆碱能神经元有作用。而作用于该部胆碱能神经元的NGF主要由靶区（海马及新皮质）产生，经逆行运输到胆碱能神经元胞体，发挥其靶源性营养作用。大量的研究表明这类神经元亚群在学习和记忆中具有特殊功能。
　　在培养PC12细胞的培养基中加入NGF时，能诱导PC12突起的生长并使酶的活性提高，但当注射NGF到PC12细胞体或胞核时，并不发生以上变化，从而说明NGF生理功能的启动是由膜受体介导的。进一步研究发现，NGF效应细胞膜上有两种受体类型，根据其对NGF的亲和性分为高亲和力受体（high affinity receptor,HNGFR）和低亲和力受体（low affinity receptor,LNGFR）。LNGFR是一种富含半胱氨酸的糖蛋白，其分子量为75kD,所以又称p75。LNGFR胞质部分没有ATP结合位点，致使NGF与p75结合后不能活化内源性激酶，故NGF与p75的结合不能直接发挥生物学效应，但能通过增加HNGFR与NGF的结合率，影响通过HNGFR进行的信号传递。1991年Klein[1]等研究发现HNGFR是由酪氨酸激酶原癌基因（tyrosine kinase proto-oncogene,TrK）表达的一种跨膜糖蛋白，分子量为140kD。现已知HNGFR至少有一个亚基由TrkA原癌基因编码。TrkA由三部分组成：即辨别并结合NGF的细胞外部、跨膜部及含酪氨酸激酶的胞质部。TrkA是NGF的功能性受体，当其与NGF结合后，可激活酪氨酸激酶信号传递系统，从而启动细胞活性，产生生物效应。Boissiere[2]等用免疫组化方法检测人基底前脑，发现99%胆碱能神经元有TrkA表达；有人用原位杂交和免疫组化方法发现TrkA mRNA和蛋白质广泛地分布于大鼠中枢神经系统[3]。在基底前脑表达TrkA mRNA的胆碱能纤维广泛地投射到海马和新皮质。
　　1 发育过程中基底前脑TrkA表达的变化
　　利用免疫组化方法证实在成年大鼠基底前脑的胆碱能神经元有p75和TrkA的表达[4]，有人用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）探及到胚胎17天大鼠基底前脑胆碱能神经元无TrkA mRNA表达[5]，生后3天到2周才发现有TrkA mRNA的表达；Li[6]等用原位杂交和Northern印迹等方法定量分析TrkA mRNA、ChAT mRNA在大白鼠胚胎、生后、成年基底前脑内侧隔核（MS）的变化。发现胚胎17天时均无表达，生后0天少数几个细胞表达TrkA mRNA、ChAT mRNA；生后4天至11天，两者表达明显增加，生后21天表达最强，高于成年鼠的水平。生后30天呈下降趋势，在成年鼠维持在一个相对稳定比较高的水平。TrkA mRNA和ChAT mRNA的表达有相似的时空模式。最近有人用免疫组织化学方法观察TrkA表达，无ChAT表达，生后5天可见ChAT表达，生后20天TrkA mRNA表达达高峰；生后30天下调，成年时维持相对较高水平，老年时TrkA mRNA表达明显下调。大鼠基底前脑Meynert基底核TrkA表达早于ChAT表达。从生后5天起，TrkA、ChAT表达有相似的时间模式。TrkA可能参与Meynert基底核胆碱能神经元的发育、分化、成熟。NGF mRNA、TrkA mRNA在发育过程中的变化对于基底前脑胆碱能神经元的存活及突起形成可能起一定的调节作用。在脑发育不同阶段基底前脑胆碱能神经元TrkA基因表达具有阶段性差异，Hsiang[7]等用原位杂交方法发现，在出生后1天大鼠基底前脑胆碱能神经元没有测到TrkA基因，以后逐渐增加，4周时达最高水平，这种发育阶段的变化与海马及皮质中NGF mRNA基因表达的变化有平行关系[8]，提示NGF对胆碱能神经元发育的调控作用，也反应了这个过程中NGF受体对这种调控的参与。
　　2 老龄鼠和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）病人基底前脑胆碱能神经元TrkA、ChAT表达的变化
　　Cooper[9]等将125I-NGF注射入成年大鼠和老龄大鼠（26～30个月）海马内，发现老龄鼠内侧隔核能摄取和逆行转动125I-NGF的ChAT免疫反应神经元数目减少31%，不能摄取和逆行转运125I-NGF的胆碱能神经元严重萎缩、胞体的平均面积减少60%，同时，TrkA mRNA表达下调43%，而p75没有差异。表明老龄鼠基底前脑胆碱能神经元维持受体介导靶源性神经营养因子的摄取和逆行转运能力下降，导致NGF信号传递功能削弱。增加了老年动物胆碱能神经元变性的易感性。最近我们用免疫组织化学方法发现老龄鼠（Meynert）基底核（basal nucleus of Meynert,nBM）TrkA、ChAT-IR神经元萎缩、数量分别减少31.9%、37.5%；胞体平均截面积分别减少39.4%、30.4%；平均灰度分别减少11.8%、9.9%。早老性痴呆是由于基底前脑胆碱能神经元的变性死亡及相应皮质、海马神经元退化所引起的老年神经元退行性疾病，其主要临床表现为学习及记忆功能障碍，导致严重的智力低下。多数学者认为AD病因主要与乙酰胆碱能系统改变有关。Boissiere[10，11]等用原位杂交方法发现AD病人与老年人对照组比较，nBM胆碱能神经元TrkA mRNA表达减少75%，差异有显著性（P＜0.001）；腹侧纹状体（ventral atriatum）TrkA mRNA表达减少41%（P＜0.01）。豆状核壳（putamen）TrkA mRNA表达减少43%～53%（P＜0.01）。Mufson[12]等用原位杂交方法发现AD病人与老年人对照组比较，nBM胆碱能神经元TrkA mRNA表达减少66%，用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法也得出同样的结论。进一步用免疫组化方法研究发现：AD病人nBM内胆碱能神经元TrkA蛋白质表达与老年人对照组比较，AD病人nBM内幸存的TrkA iR阳性神经元数量减少60%，染色密度减少35%，细胞外形皱缩，树突截断变形，整个细胞呈肿胀的球形外观（swollen globose appearance）[13]。
　　3 TrkA对于基底前脑胆碱能神经元的作用
　　Fagan[14]等将小鼠基底前脑、纹状体胆碱能神经元编码TrkA受体的基因失活（TrkA-/-）发现生后7天小鼠基底前脑、纹状体胆碱能神经元ChAT-IR阳性产物胞体的平均截面积减少10%～20%；生后20～25天小鼠ChAT-IR阳性神经元数目20%～36%，胞体萎缩变小，ChAT免疫反应性降低，胞体和胆碱能神经纤维毡标记密度减少，表明正在发育的（TrkA-/-）小鼠胆碱能神经元ChAT表达减少，阻碍发育成熟。结果表明正在发育（TrkA-/-）小鼠胆碱能神经元ChAT的表达减少，细胞死亡增加。（TrkA-/-）小鼠基底前脑胆碱能神经元丢失与生后1～4周时，靶源性神经营养因子缺失导致细胞死亡是一致的[15]。缺乏TrkA受体，NGF不能与特异性的受体结合，不能进行细胞内信号传递，正在发育的基底前脑胆碱能神经元不能充分地发育成熟。
　　4 TrkA与ChAT、雌激素受体（estrogen receptor,ER）共存
　　Sobreviela[16]等用免疫组化方法发现：内侧隔核和斜角带核内95%以上TrkA免疫反应阳性神经元内既含有ChAT也含有p75 nGFR；Meynert基底核内80%以上TrkA免疫反应阳性神经元内含有ChAT，95%以上的TrkA免疫反应阳性神经元内含有p75。Gibbs[17]等用免疫组化方法证明50%～80%的胆碱能ChAT免疫反应神经元内含有ER，雌性大鼠较雄性大鼠多10.5%。纹状体内双标细胞占74.2%，斜角带核水平支内为63.4%。Toran[18，19]等用放射自显影和原位杂交、免疫组化方法发现基底前脑胆碱能神经元含有雌性激素的高亲和性连接位点，即雌激素受体，属核受体，为一核转录因子。结果提示它们的配体（神经营养因子、雌性激素）可能作用于同一神经元，协同调节细胞内特异的基因或者基因网络的表达。从而调控mRNA的细胞内组成，影响蛋白质生成的量及其性质，最终影响神经元的存活、分化、再生和可塑性。
　　5 雌性激素对于基底前脑胆碱能神经元TrkA mRNA和ChAT mRNA表达的调节
　　Pamela[20]等人将成年大白鼠卵巢切除后10天，HDB和nBM内TrkA mRNA表达水平分别下调56%和34%，而ChAT mRNA分别下调38%～65%，与Gibbs[21]等人研究结果相似。雌性激素替代治疗3天后，TrkA mRNA、ChAT mRNA表达恢复到未切卵巢的动物的水平，而VDB中的TrkA mRNA、ChAT mRNA表达没有明显的差异。Gibbs[22]等观察鼠龄分别为13个月、19个月和25个月的雄性、雌性大鼠，发现年龄对于MS、nBM内ChAT、p75免疫反应阳性神经元的细胞大小、纤维染色密度的影响没有显著性差异，13～25个月龄鼠中，25个月龄鼠TrkA mRNA明显地减少。将13个月龄鼠卵巢切除6个月后，MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA明显地减少，短期内雌性激素替代治疗后，MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA明显地减少，短期内雌性激素替代治疗后，MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA部分恢复。结果提示卵巢分泌的雌激素对于大白鼠基底前脑MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA维持正常水平发挥重要作用。卵巢切除后，MS和nBM内TrkA mRNA表达减少，对于内源性的神经生长因子效应降低，基底前脑对于衰老和疾病的易感性增加，胆碱能神经元的功能下降。因此，长期的卵巢功能丧失，对基底前脑胆碱能神经元将产生不利影响。雌性激素替代治疗绝经后的妇女有助于减少其患AD病的可能。
　　6 雌性激素和NGF协同作用，可望应用于临床
　　雌性激素能够上调神经营养因子和它们的受体的表达，而NGF能够增加ChAT mRNA的数量，增强ChAT的活性，从而增加Ach的释放。雌性激素对于胆碱能系统神经元的营养作用可能部分地经过神经营养因子与其受体结合后传递信息而被介导。Gibbs等研究发现雌性激素的剂量和给药治疗的周期不同，它对神经营养因子基因以及受体的表达有不同的效果。临床应用中绝经后的妇女用雌性激素替代治疗可以预防AD病的发生[21]，但是乳腺癌发病率明显增高这一副作用也不容忽视。雌性激素和NGF协同应用于临床还有待于进一步的探索。

参考文献
　　1 Klein R,et al.Cell,1991;65:189
　　2 Boissiere F,et al.C-R-Acad-Sci-Ⅲ，1994;37(11):997
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　　6 Li Yiwen,et al.J Neurosci,1995;15(4):2888
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　　11 Boissiere F,et al.Dement Geriatr Cogn Disord,1997;8:1
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　　15 Crowley C,et al.Cell,1994;76:1001
　　16 Sobreviela T,et al.J Comp Neurol,1994;350:587
　　17 Gibbs RB.Brain Res,1996;720:61
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　　19 Miranda RC,et al.Horm Behav,1994;28:367
　　20 Pamela J,et al.J Neurosci,1996;16:1860
　　21 Gibbs RB,et al.Exp Neurol,1994;129:70
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