关键词： 核酶；基因治疗
摘要：80年代初，由美国科学家Cech和Altman发现了核酶（Ribozyme）,随着人类基因工程研究的深入，部分临床实验室工作者和基础科学研究人员开始注意到Ribozym在基因治疗中的应用潜力。近几年来，人们利用Ribozyme可以特异性地切割靶RNA序列的特点，设计适合的Ribozyme阻断特定基因的表达，相继对艾滋病、肿瘤、生殖系统疾病、肝炎、白血病、移植排斥反应等疾病进行了大量研究。试验结果表明Ribozyme作为基因治疗的一种方法有着广阔的应用前景和极大的临床实用价值。
Advance in Study of Gene Therapy by Ribozyme
核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列。迄今，人们发现的核酶有六种类型，即1类内含子、RNaseP、锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎核酶及VS核酶，但从结构上看主要分为两大类［1］：锤头状核酶和发夹状核酶。锤头状核酶长约30个核苷酸，由三个碱基配对的螺旋区、两个单链区和膨出的核苷酸构成。该酶可分为3个部分，中间是以单链形式存在的13个保守核苷酸和螺旋Ⅱ组成的催化核心，两侧的螺旋Ⅰ/Ⅲ为可变序列，共同组成特异性序列，决定核酶的特异性。发夹状核酶切割活性所需最小长度为50个核苷酸，其中15个是必需的。该酶由4个螺旋区（H）和数个环状区（J）组成 。螺旋Ⅰ、Ⅱ 的主要功能是与靶序列结合，决定核酶切割部位的特异性，螺旋Ⅲ配对碱基及其3′端的未配对碱基均为切割活性所必需。核酶的作用原理为核酶的特异性序列通过互补碱基对形成识别并结合特异性靶RNA，根据这一特性可以人工设计针对某一RNA的核酶分子，破坏病毒转录产物而对机体无害，将针对多个位点的核酶序列串连成一个多靶位核酶分子可以大大提高切割效率，达到治疗目的。因为其独特的优点：（1）序列特异性；（2）不编码蛋白质，无免疫原性；（3）可以重复使用。使其在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。
基因治疗是目前分子水平研究领域中的一个热点，即将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因,从而达到治疗目的。经过国内外科学家十余年的努力，基因治疗已从实验室研究阶段过渡到临床试用阶段，其治疗范围已从过去的单基因疾病扩大至多基因疾病，治疗病种涉及面广，目前成为临床治疗一种很有潜力的新方法。
1 核酶在抗HIV中的研究进展
HIV可分为HIV-1和HIV-2，至少可以编码9种蛋白，研究者从不同角度选择合适的靶基因。HIV的PBS（Primer binding site）是一个18核苷酸序列和tRNA的3′末端互补。实验分析展示这段序列是一段高度保守序列，Amer等［2］针对这段序列设计了锤头状核酶，抑制了HIV-1在体内的复制，5′端引导序列是一个诱导区域，对所有HIVRNA的转录和翻译都十分重要。通常在此位置剪切产生5′片段，可竞争抑制HIV的复制和转录。Weersinghe等［3］以此为靶位点，设计了不同的核酶，使HIV-1的表达下降达95%。Phylactou等［4］在ф位点设计剪切位点，此位点是HIV的包装序列，使P24表达水平下降80%～90%。Westaway等［5］设计锤头状核酶剪切U5 破坏HIV的翻译，U5区是连接mRNA帽状结构的起始区，此实验取得理想的结果。Wang等［6］相继报道了抗HIV-1新的核酶靶位点：nef开放读码框，细胞内的研究结果表明，核酶可在逆转录开始和原病毒DNA整合前发挥有效作用。因此认为nef开放读码框是核酶抗HIV-1感染的新的有效靶位点。HIV-1tat基因是反式激活基因，对HIV的复制至关重要，Konopka等［7］针对tat基因的编码区设计锤头状核酶RZ2,将其克隆到逆转录病毒载体中，转染到人外周血T淋巴细胞，检测RZ2的活性，实验证明此核酶有效抑制HIV-1ⅢB的复制。
为提高核酶的切割效率，对设计合成后的核酶可采用体外修饰，通常对2′-OH进行修饰。实验证明其体外活性可提高6倍，稳定性提高2倍。据报道国外一些实验室已设计出第二代核酶，针对靶RNA分子的不同位点进行破坏，大大提高核酶的剪切效率。Chen等设计了9位点核酶，Sun等设计了3位点核酶抑制HIV-1的转录。Alessandro等［8］在前体RNA被剪切和转运到细胞质之前，设计特异性的核酶并将其插入剪接体U1小核RNA（SnRNA）中，其衍生物和反向mRNA5′端剪切位点互补，在人类T细胞系中测试该核酶的活性。结果显示该核酶抑制HIV-1在细胞内的转录，并使P24表达水平大大降低。Koizumi等［9］设计了三种核酶，一个发夹状核酶HR112，两个锤头状核酶RZ115和RZ119，分别导入CEM细胞系中，特异性地切割HIV-1RNA长末端重复序列（Long terminal repeat，LTR）的U5区，结果显示此三种核酶具有抗HIV-1ⅢB的作用，且HR112和RZ119有极强的抗HIV-1感染作用。
2 核酶在抗生殖道感染的研究进展
尖锐湿疣（Condyioma accuminatum）又称生殖道疣，是一种由人乳头瘤病毒（HPV）引起的性传播疾病。近30年来，其发病率持续增高，已鉴定的HPV有70多型，其中与尖锐湿疣最为相关的是HPV6、11型，其HPV早期基因组（E1、E2、E4、E5、E6和E7基因）的转录是HPV在宿主细胞中增殖的关键步骤。转录的主要调节系统在于上游调控区（LCR）中，调控蛋白是E2蛋白，为45～48KD，以二聚体形式结合于DNA，全长E2蛋白是一个典型的反式激活蛋白，它能以二聚体的活性形式特异的结合于上游调控区的E2结合位点ACCN6GGT，可使HPV早期基因组的转录水平提高20～100倍。此外E1是HPVDNA的复制蛋白，复制结构功能域位于蛋白的末端，E1功能的实现是通过与上游调控区（URR）中的复制起点（0rigin,Ori）内跨越nt1位，长18bp的一段反向重复结构结合后发挥ATP酶依赖的DNA解旋酶作用而开始从ori起始整个HPV基因组DNA复制的。E6基因能与抑癌基因p53的产物及细胞内的E6相关蛋白（E6-AP）结合而导致p53基因降解失活，E7蛋白与Rb抑癌基因的结合影响Rb与细胞转录因子E2F结合，使E2F与Rb分离而影响Rb表达。Huang等针对HPV6a 6b、11E1 mRNA的3′端和E2 mRNA的5′端（两个起始密码子AUG之间的区域）中的保守序列，分别设计合成具有反义抑制和切割活性的锤头状核酶，进行体外切割实验，筛选出具有高效切割活性的2～3种核酶，分别合成Ribozyme的基因串联后形成多功能Ribozyme基因，并合成只具有反义作用的反义基因作对照。
宫颈瘤是常见的人类生殖道肿瘤，研究证实宫颈瘤组织及其细胞系中，一般都有HPVE6/E7基因的高水平表达，HPVE6/E7蛋白可通过其N-端38个氨基酸与肿瘤抑制基因产物RB蛋白结合而使其功能失活，导致细胞周期调控的紊乱和细胞染色体的不稳定。Alvarez等［10］针对HPV16E6/E75端和3断设计出抗E6/E7的发夹状核酶RZ343和RZ523特异性切割E6、E7RNA片段，应用启动子RSV-LTR提高转录效率，通过钙-磷酸盐共沉淀法将pRSV-RZ523导入CV-1细胞糸中，斑点-印迹杂交法显示此核酶在CV-1细胞中高效表达，密度扫描结果显示表达水平约为9.0pmol/106个细胞，表达的活性核酶的量至少为50fmol/106个细胞，细胞连续培养4周后，细胞形态无明显改变，说明核酶的长期表达对细胞本身无明显的毒性影响。通过Rnase保护测定结果（Result of RNase protection assay）表明，在CV-1细胞中的E7RNA片段减少90%，有效抑制E7基因的表达。Chen等［11］分别针对核酸位点123nt、309nt、671nt设计三种锤头状核酶切割HPV-18E6/E7基因，核酶在靶位点进行杂交，比率为20：1，体外活性切割实验表明，三种核酶均有效抑制E6/E7基因转录，其中RZ309切割效率最高。Lu等［12］设计两种核酶，切割编码HPV-16E6/E7开放阅读框架（Open reading frames ORF）的所有转录产物，切割位点为病毒基因链RNA上的110nt和558nt，将其插入到腺病毒载体，采用T7噬菌体启动子，实验结果显示此两种酶大大降低HPV-16E6/E7基因的表达。
3 核酶在抗肝炎病毒中的研究进展
我国是肝炎病毒感染的高发区，一直以来肝炎的治疗是临床医生颇为关注的问题。Birikh等［13］用一条合成的寡脱氧核苷酸链而来的三个核酶同时进行实验发现，HBVRNA可被核酶介导切割，从同一DNA模板转录的3条核酶可同时发挥作用，多核酶的表达将有益于对抗高的病毒目标序列变异。Aoki等［14］设计合成了针对HBVayw株P基因5′端2360位点的RCP，其作用底物为HBVaywP基因的翻译起始区（2140～2422区段），并将该核酶基因克隆到表达载体pSVL上，利用脂质体介导的DNA转染技术，将该核酶的基因引入到HepG2215细胞中(HepG2215细胞系由头尾相接的HBV对拷贝基因组转染肝癌细胞系HepG而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系)。实验证明，针对P基因5′端的核酶RCP对HbeAg和HbcAg的表达有一定程度抑制作用。Phylactou等首次使用发夹式核酶，作为抗HCV感染的有效治疗物质，阻碍病毒基因组的复制，保护细胞免受HCV感染，其设计合成的核酶针对5′-非翻译区（5-UTR）及编码衣壳蛋白的区域，实验表明针对编码HCV衣壳蛋白区域的核酶成为有希望抗HCV感染的一种治疗途径。Leontis等［15］使用了5-NCR翻译有关的虫荧光素酶报告基因系统作为敏感的定量研究方法，分别设计出针对核酸位点136-160，313-317，496-520，及对373-388的四种核酶，证实核酶1、4在无细胞环境中均有效。而2、4在细胞内有效。推测核酶1、3的目标位点可能为双链区，而核酶2、4目标位点可能为单链区。
Langon等［16］针对HDV设计合成特异性核酶，切割位点位于基因链RNA的688/689nt和反基因链RNA的903/904nt，其切割活性的最短序列为84nt,所设计的核酶为复杂的三维结构，通过对反基因链RNA核酶25个位置进行代偿突变和共突变的实验，发现有8对碱基在空间结构上发挥相互作用。HDV核酶的研究对肝炎疾病的基因治疗带来了希望。
4 核酶在抗白血病中的研究进展
bcr-abl融合基因编码的具有异常蛋白酪氨酸激酶活性的p210蛋白是导致慢粒细胞白血病（Chronic myoloid leukemia, CML）发生的主要原因。Daley等［17］对bcl-abc融合基因cDNA序列，在融合位点的上游第-296bp,-1bp及下游15bp处分别设计3个相邻的锤头状核酶基因及侧翼序列，用于核酶的相互连接。实验结果显示，以上3个核酶均可特异性结合于融合基因mRNA 相应位点，给多步基因重组后，3个单核酶按相应顺序定向克隆到pDES载体中，构建成功单核酶pDES-RZ1，双核酶pDES-RZ12及三核酶切割载体pDES-RZ123。三核酶的联合作用明显提高核酶切割效率，抑制了融合蛋白的激酶活性。在急性早幼粒白血病病人（Acute promyelocytic leukemia,APL FAB，M3）中,t(15,17)的重新排列产生了一个融合性的转录产物(Fusion transcript)PML/RARа,而PML/RARа的表达和白血病基因的复制及治疗药物全反式维甲酸的作用密切相关。Nason等［18］针对PML/RARаmRNA设计合成锤头状核酶APL1.1(51nt)，将其克隆到pGEM4载体中，采用T7启动子，用ECORⅠ酶切，在NB4APL细胞中表达，培养周期6天，剪切过程中核酶5′端和3′端自动释放，试验结果显示PML/RARа蛋白在该细胞中表达明显降低。
5 核酶在抗移植排斥反应的研究进展
同种异型骨髓移植常易发生移植排斥反应，长期以来是临床医生最焦虑的问题，用啮齿类动物建立模型研究穿孔素（Perforin）和FAS配体（FAS L），此为两种独立的裂解途径组成成分，大量实验显示这两种成分诱导了移植排斥反应。Du等［19］设计两种锤头状核酶在CTLL-2细胞中高效切割靶RNA的穿孔素和FAS配体，在tRNA诱导的RNA多聚酶Ⅲ启动子表达这两种核酶，将其插入来源于乳头瘤病毒多拷贝质粒，构建嵌合型有特异性二级结构的抗穿孔素和抗FASLtRNA核酶，此二级结构能使核酶易从tRNA功能域中分离出来。实验结果分析表明成功构建的核酶在CELL-2细胞中使穿孔素和FAS配体基因表达明显降低。
综上所述，近几年来随着对核酶研究的深入，为人类在基因治疗的道路上带来了曙光。由于其可以无法恢复地使靶基因失活，可在体外循环使用，并且其催化效率较反义寡核苷酸明显提高等独特优势而受到科研工作者的关注。10年来在治疗研究领域中所取得的重大进展都表明核酶在临床疾病的治疗中具有极大的潜在应用前景。但是核酶技术尚未完善，靶位点的最佳选择、载体的选择、导入体内的稳定性、切割效率，这些因素都阻碍着核酶在临床疾病基因治疗上的实施。近来，伴随着多位点核酶的设计并将其串联组成多功能核酶提高切割效率，运用逆转录载体技术的提高，对核酶进行化学修饰，及阳离子脂质体导入技术的发展都给核酶技术的研究带来更大的希望。不久的将来，核酶会成为一种极有前途的抗病药物，其特异性、高效性将在人类基因治疗领域中取得一定成果。
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