关键词： 一氧化氮(NO) 关节疾病 炎症
一氧化氮(nitric oxide,NO)是由L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)胍基氮经NO合酶(NO synthase，NOS)的催化发生氧化而形成。NO既兼有第二信使和神经递质的功能，又是效应分子，介导和调节多种生理和病理过程〔1，2〕。Stadler等〔3〕于1991年用白介素1(interleukin 1，IL-1)或内毒素诱导软骨细胞合成NO，提供了软骨代谢涉及NO的最早证据。1992年Farrell等〔4〕发现在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和骨关节炎(osteoarthritis，OA)病人的滑膜液和血清中可检测到大量NO代谢产物亚硝酸盐(nitrite，NO－2)，推测NO可能参与这二种疾病关节炎症的病理过程。以后诸多学者〔5，6〕使用NOS抑制剂等工具药对多种关节炎动物模型进行了研究，证实NO是这些关节炎发病过程中的一种重要炎症介质，由此推动了NO与炎症性关节疾病关系的深入研究。本文就NO涉及炎症性关节疾病以及有关药物治疗方面的进展作一综述。
1 NO参与炎症性关节疾病的发病过程
1.1 关节炎病人：RA和OA滑膜液或血清中NO－2含量以及尿中硝酸盐(nitrate，NO－3)或NO－2/NO－3排出量均高于正常人〔4，7～9〕。强的松龙0.5 mg/kg口服，连续2～4周，不但降低RA患者C反应蛋白、血沉、晨僵时间与关节疼痛指数，而且还明显减少尿中NO－3排出。给活动期RA患者甲基强的松龙冲击治疗，1 g/d，连续3天，第4天患者滑膜液中S-亚硝基蛋白(S-nitrosoproteins，S-NP)含量明显减少，且与患者症状、体征以及实验室指标改善呈明显正相关，表明NO可能参与炎症性关节疾病的发病过程。
1.2 关节炎动物模型：NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine，L-NAME)或NG-单甲基-L-精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine，L-NMMA)，不仅降低佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠不同时期尿中NO－2/NO－3含量，而且减轻相应时间的足肿胀度、踝关节滑膜炎和软骨损伤等病理变化〔6〕。Cannon等〔10〕动态比较了AA大鼠和胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠的发病程度与体内NO－3排出量的关系，发现两者的高峰时间不同，且后者均先于前者。在关节炎发病的不同阶段，AA大鼠尿中NO－3含量均明显高于CIA大鼠，其关节、肝和脾脏中诱导型NOS(iNOS)mRNA表达水平明显高于CIA大鼠，表明NO在两种关节炎模型中所起的作用存在差异。其他关节炎模型，如MRL-lpr/lpr小鼠可自发形成关节炎，其尿中NO－2/NO－3排出以及腹腔巨噬细胞iNOS mRNA表达均明显增多〔5〕。iNOS基因敲除(knock-out)小鼠对角叉菜胶诱导炎症反应的敏感度降低〔11〕。给大鼠膝关节腔注射NO供体药亚硝基铁氰化钠(sodium nitroprusside，SNP)，不但引起膝关节肿胀，还可引起滑膜炎等病理变化，进一步证实了NO作为一种炎症介质直接参与了炎症反应和关节损伤过程〔12〕。
2 NO参与炎症关节损伤的作用机制
生理条件下，NO通过激活鸟苷酸环化酶催化GTP产生cGMP发挥作用〔2〕。NO参与炎症反应和关节损伤是通过以下途径实现的。
2.1 NO促进其他炎症介质的释放
2.1.1 前列腺素E2(PGE2)：Salvemini等〔13〕报道，NO可通过激活环氧酶促进PGE2产生。体外实验结果〔14〕表明，L-NMMA可浓度依赖性拮抗IL-1，抑制软骨细胞增殖反应和促进PGE2产生，而SNP可诱导软骨细胞产生PGE2并抑制其增殖反应，提示IL-1的上述作用是通过NO介导的。相反，IL-1体外主要促进滑膜成纤维细胞增殖反应，这是由于IL-1诱导滑膜成纤维细胞产生NO明显低于软骨细胞，从而对滑膜成纤维细胞PGE2的产生无明显促进作用〔15〕，这有助于解释RA滑膜成纤维细胞高度增殖形成血管翳以及关节软骨的破坏作用。
2.1.2 炎性细胞因子：RA滑膜液中NO－2与TNF-α等细胞因子含量明显增高。NO供体药S-亚硝基乙酰青霉胺(S-nitroso-acethylpenicillamine，SNAP)可浓度依赖性促进RA滑膜细胞产生TNF-α〔16〕。另一NO供体药S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitroso-glutathione，S-NO-GSH)亦可明显促进INF-γ和脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α和IL-1α〔17〕。提示，NO对RA关节损伤作用可能与其促进TNF-α和IL-1α产生有关。
2.2 增强金属蛋白酶活性
IL-1β、TNF-α和内毒素联合应用能分别诱导人或牛软骨细胞产生NO和增强金属蛋白酶活性。L-NAME可抑制其NO产生及金属蛋白酶活性。SNAP可浓度依赖性诱导软骨细胞金属蛋白酶活性增强，表明NO可增强金属蛋白酶活性〔18〕。金属蛋白酶激活可引起软骨基质降解。IL-1诱导软骨释放NO并促进软骨基质蛋白多糖的降解可能与此途径有关。
2.3 与 过氧亚硝酸根离子(ONOO-)有直接毒性作用，可使含酪氨酸的蛋白硝基化，生成硝基化酪氨酸，使抗氧化酶失活。RA滑膜液和血清以及角叉菜胶诱导大鼠足肿胀模型的炎症关节局部均可检测出硝基化酪氨酸〔19〕。ONOO还可分解为作用更强的羟自由基，引起关节局部组织脂质过氧化，从而加重炎症关节损伤〔5〕。
2.4 抑制滑膜的T细胞浸润
免疫组化结果表明，RA滑膜组织浸润的T细胞明显少于单核细胞〔16〕。我们结果表明AA大鼠脾细胞增殖反应降低是由于激活的巨噬细胞产生大量NO抑制T细胞增殖反应所致〔20〕。RA患者滑膜细胞高度激活产生NO，由此抑制关节局部T细胞的浸润、增殖和分泌功能，从而减少了Th2细胞分泌IL-10、IL-4等其负反馈调节作用的细胞因子〔16〕。
此外，NO还可引起人软骨细胞凋亡，从而削弱了机体对软骨损伤的修复能力。
3 药物对NO产生的调控作用
3.1 NOS抑制剂：根据NOS抑制剂的作用类型可分为〔2〕：①主要抑制结构型NOS(cNOS)，如L-硝基精氨酸(N-nitro-L-arginine，L-NNA)。②主要抑制iNOS，如L-N6-(1-亚胺乙基)-赖氨酸〔L-N6-(1-iminoethyl)-lysine，L-NIL〕、氨基胍(aminoguanidine，AG)。③非选择性抑制cNOS和iNOS，如L-NMMA、L-NAME。连续使用L-NMMA 20天后，少数AA大鼠有蛋白尿，表明肾功能降低可能与其抑制cNOS的作用有关〔6〕。但亦有相反的报道〔19〕，L-NMMA或L-NAME可抑制不同时期大鼠角叉菜胶诱导炎性足肿胀，而L-NIL或AG均不抑制早期足肿胀，仅抑制炎症后期足肿胀，提示早期炎症和后期炎症反应分别由cNOS和iNOS催化生成NO介导的。因此，只有弄清cNOS催化生成NO在炎症性关节疾病中所起的作用后，才能在临床上合理使用选择性还是非选择性iNOS抑制剂，或同时使用NO供体药减轻非选择性NOS抑制剂引起的不良反应。
3.2 甾类消炎药：甾类消炎药为iNOS抑制剂〔5〕。甾类消炎药对RA患者的治疗作用与其降低体内NO生成有关〔7〕。但亦有资料报道，地塞米松或氢化可的松对IL-1诱导人或兔软骨细胞产生NO的抑制作用轻微，对OA患者软骨细胞产生NO无明显抑制作用〔21〕，提示此类药物对软骨损伤无保护作用。
3.3 非甾类消炎药：治疗浓度的乙酰水杨酸可抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞iNOS蛋白表达和NO－2产生，但不影响iNOS mRNA表达；乙酰水杨酸对从巨噬细胞提取的iNOS蛋白的催化活性也有明显抑制作用。而治疗浓度的水杨酸钠或吲哚美辛对上述作用均无影响。乙酰咪唑亦具有与乙酰水杨酸类似作用，而咪唑却无作用。乙酰水杨酸体外亦可抑制OA软骨组织产生NO〔22〕。因此，开发这类具有乙酰化基团的新型非甾类消炎药治疗炎症性关节疾病将有重要意义。
3.4 改善病情药物：Kwon等〔23〕检测小鼠巨噬细胞iNOS蛋白的催化活性时，发现甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)可完全抑制二氢生物蝶呤，促进L-Arg转化生成NO。环孢菌素A(cyclosporin A,CsA)体外可浓度依赖性抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生NO，表明MTX和CsA的抗关节炎作用可能与其抑制NOS的催化活性有关〔5〕。金诺芬虽不能抑制兔和大鼠体内NO的产生，但可降低血管以及组织对NO的敏感性，这一作用是否与治疗作用有关，有待进一步证实〔5〕。
此外，四环素类药物多西环素和米诺环素的药理剂量可明显抑制iNOS mRNA的表达，降低OA患者软骨细胞以及小鼠巨噬细胞iNOSR的催化活性〔24〕，从而说明了四环素类药物治疗RA与其降低过高的NO生成有关。
3.5 生物制剂：Miesel〔25〕等报道，IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist,IL-lra)不仅抑制过氧铬酸钾足跖皮下注射引起小鼠关节炎症反应，而且降低体内NO生成。IL-lra体外抑制IL-1诱导兔滑膜细胞胶原酶增高的活性与其降低NO产生有关。由于这类生物制剂选择性高，并可明显抑制iNOS蛋白以及iNOS mRNA表达等作用，预计这类药物对RA等炎症性关节疾病将有较好的应用前景。
3.6 中药：白芍总甙(TGP)为抗炎免疫调节药。动物实验结果表明，TGP对AA大鼠抗关节炎作用与其抑制巨噬细胞过高分泌NO、TNF等有关〔26〕，提示TGP治疗RA可能与抑制体内NO生成有关。雷公藤多甙在抑制AA大鼠继发炎症反应的同时，亦降低大鼠血清中NO－2/NO－3含量。尽管这些中药有效成分抗关节炎作用机制与抑制NO产生有关，但它们治疗RA等慢性炎症疾病与NO的关系尚待研究。
4 问题与展望
4.1 体内检测NO：由于NO半衰期仅有几秒钟，很快代谢或转化为其他产物。因此，能反映体内NO代谢情况的检测指标受到广泛的关注。人体通常只能从尿液、血液或滑膜液中检测NO水平。NO－2是内源性NO产生的主要标志性代谢物，但很快氧化生成NO－3，体内后者含量比前者高出100倍左右。因此，检测体液中NO－2＋NO－3(即NO－2/NO－3)量才可代表NO代谢产物〔2〕。NO－2和NO－3尤其后者易受食物组成的影响。Grabowski等〔8〕认为，患者检测前一天晚上禁食，其晨尿中NO－3与肌酐比率可排除食物的干扰。
除检测NO代谢产物外，对其体内转化产物的检测亦受到重视。体液中S-NP或硝基化酪氨酸含量，间接反映了NO对组织损伤作用及其强度〔9，27〕。最近Wigand等〔28〕报道，活动期RA患者血清中NG-羟基-L-精氨酸(NG-hydrooxy-L-arginine,L-NHA)含量明显增高，而非活动期RA血清中L-NHA无明显改变。L-NHA为NOS代谢产物，除NOS外，尚未发现体内其他来源的L-NHA。若能同步检测体液中NO代谢或转化产物以及NOS的代谢产物有助于了解疾病的状况以及评价药物的治疗作用。
4.2 NO与滑膜细胞凋亡：RA滑膜的高度增生类似肿瘤样改变，可能与细胞凋亡不足有关。我们发现，SNP可引起兔软骨细胞凋亡，但未能引起兔滑膜成纤维细胞的凋亡〔12〕。最近Aupperle等〔29〕报道，NO不能诱导RA滑膜成纤维细胞凋亡与其p53基因表达减少有关，这一现象值得深入研究。
4.3 展望：自1987年提出内皮依赖舒张因子为NO之后，NO的基础与临床研究进展很快。尽管NO在炎症性关节疾病中的作用还在深入研究，但可以肯定iNOS催化生成NO在这些疾病发病过程中起重要作用。因此，使用选择性高的iNOS抑制剂或用药物抑制iNOS蛋白或/和iNOS mRNA的表达可为RA等炎症性关节疾病提供一种新的治疗途径。
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