论文作者：彭娟 杨骥 郭锐 贾金平 王亚林

摘要：回顾了生物法脱除煤中有机硫的研究历史，综述了脱有机硫菌种的筛选、分离、性质测定与鉴定等的常用方法，同时阐述了近几年来在分子生物学和酶学方面取得的重大进展，并对一些处于研究阶段的工艺进行了简要介绍，最后提出了生物法脱除煤中有机硫现在所面临的主要问题，并对今后的发展方向进行了展望。

关键词：生物脱硫 煤 有机硫 二苯并噻吩

　　煤作为一种十分重要的化石能源被广泛使用。我国是一个产煤大国，煤是我国的能源支柱。然而，我国煤炭中高硫煤的储量很大，我国各大煤区煤田中含硫2.0%以上的高硫煤中有机硫所占的比例如表1所示。在高硫煤中，有机硫占煤层煤样储量全硫的34%~40%^[1]。燃煤也带来了严重的污染。我国城市降水中SO₄^2-含量高于外国，酸雨现象十分严重^[2]。

　　表1 我国高硫煤中有机硫的分布^[1]

　　煤中的硫可分为无机硫和有机硫两大类，无机硫的脱除已经非常成熟，而煤中有机硫主要以硫醇硫、硫醚硫和噻吩硫的形式存在，因其复杂的结构，尚无工业化的技术，它的脱除则是目前研究的重点^[3]。

　　煤中有机硫的脱除技术有主要有物理法、化学法及生物法三种。物理法对有机硫的脱除效率几乎为零，化学法是目前应用的主要方法，但是很难分解其中的噻吩硫，而且在较强的反应条件下，煤的结构会被破坏，造成比较大的热值损失。煤的生物脱硫是由生物湿法冶金技术发展而来的，它是利用微生物代谢过程中的氧化还原反应，在常压低于100 ℃的生长条件下，达到脱硫的目的，因此能耗较低。生物法因其成本低，反应条件温和，反应专一，且环境友好，已经得到广泛的重视与研究。二苯并噻吩（Dibenzothiophene，DBT）是化石燃料中难降解有机硫化物的典型代表，因此常将其作为模型有机硫化物，以它作为唯一的硫源来筛选富集具有脱除煤中有机硫能力的微生物。

　　1 微生物脱除煤中有机硫的历史进展

　　1950年第一件石油生物脱硫专利^[4]在美国公布，生物法脱硫技术的研究自此以后广泛地开展起来。生物法脱除煤中有机硫的研究可追溯到20世纪70年代末，Chandra等^[5]于1979年首次报道有一种异养细菌可在二苯并噻吩（DBT）基质上生长，并在30 ℃下培养10 d后可除去20%的有机硫。1988年美国国家气体研究院（Institute of Gas Technology，IGT）分离出可选择性脱除DBT中硫的紫红红球菌 Rhodococcus rhodochrous IGTS8（ATCC53968）并申请了专利，这一专利于1990年被美国能源生物公司（ENBC）买断。IGTS8后来被发现能专一性地切除DBT的C—S键并将其最终转化为2-羟基联苯（2-hydroxybiphenyl，2-HBP），此后许多实验室都以DBT为唯一硫源分离具有降解DBT能力的菌株，研究分离的菌株有假单胞菌（Pseudomonas sp.）、红球菌（Rhodococcus sp.）、棒杆菌（Corynebacterium sp.）、短杆菌（Brevibacterium sp.）和分支杆菌（Mycobacterium sp.）等。

　　目前通常认为，微生物脱除DBT中有机硫有两种途径：

　　（1）以碳代谢为目的的Kodama途径，切除DBT中的C—C键，导致一个苯环发生断裂或羟基化形成水溶性化合物，或是硫原子被氧化，但噻吩核不变，有机硫并没有被脱除。被认为走这条途径的微生物有门多隆假单胞菌（Pseudomonas mendocas）^[6]，争论产碱生物变型（Alcaligenes paradoxus biovar I）^[6]，产碱假单胞菌（Pseudomonas alkaligenes），司徒茨氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeris）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）^[7]等。

　　或是微生物能以DBT为碳源和硫源生长，通过消耗环烷烃使DBT降解，硫原子最终被转化为SO₄^2-，但这样也导致了煤的热值下降较大。通常认为走这条途径的微生物有短杆菌（Brevibacterium sp. DO）、嗜酸热硫化叶菌（Sulfobus acidocaldarius）和类诺卡氏菌（Nocardioide sp.）等^[8]。

　　（2）特异性断裂C—S键，走4S途径（图1），DBT的降解产物为2-HBP，煤的热值下降小。代表性的菌株就是紫红红球菌 Rhodococcus rhodochrous IGTS8。报道的其他菌株还有红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）^[9~11]、棒杆菌（Corynebacterium sp.）^[12~15]和分支杆菌（Mycobacterium sp.）^[16~18]、类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）^[19,20]等。

　　微生物要成功有效地脱除煤中的有机硫，首要的是它必须在高硫的条件下能正常生长，其次它需要有专一性切除C—S键的能力，这样煤的热值损失才会最小，不过所有这些的前提是煤中的有机硫必须具有可生化性。降解DBT走4S途径的细菌为煤中有机硫的脱除提供了很好的研究价值。

　　图1 微生物降解DBT的“4S”途径 (Gray, 1996)

　　2 脱有机硫菌种的分离与性质测定

　　现已研究报道的通过4S途径特异性地脱除DBT中有机硫的菌株已有不少，其分离纯化的方法已经比较完善，自成体系。总结下来，大致有分为以下几步：

　　（1）取样点的选择。一般挑选煤场附近土壤、矿井水或一些焦化厂的生化池作为取样点，这些地方聚集有脱硫能力细菌的可能性最大，筛选出的细菌在有机硫基质上生存的能力也比较强。

　　（2）菌种的筛选与分离纯化。可以采用模型有机硫化合物，如DBT，为主要硫源来配备培养基，在一定条件下培养样品，目前主要是采用这种方法；也可以直接将样品与煤样、基质混合，培养一段时间后分离菌种。

　　（3）菌种脱有机硫途径的研究。一般采用DBT作为主要硫源，采用乙醚^[6]、二氯甲烷^[21]、正己烷或乙酸乙酯^[22,23]等萃取代谢产物，通过紫外分光光度计^[6,13]、GC-MS、HPLC^[13]和NMR^[20]等方法分析代谢产物的组成成分，推测菌种可能的脱硫途径。

　　（4）脱硫活力的测定。可以通过监测DBT单位时间的降解量和降解最终产物2-HBP和SO₄^2-（文献[24]报道，有些菌会同化SO₄^2-，这将导致硫仍留在煤中）单位时间的生成量来测定该菌株的脱硫活力。同时也可以结合菌的生长量来分析菌种的稳定性和生长动力学。

　　（5）煤样脱硫实验。将菌种接种到煤中，同时添加适量的营养盐，培养一段时间后，观察煤中总硫和有机硫的去除^[6]。

　　（6）菌种的鉴定。主要是研究菌种的生理生化特性和16S rDNA的同源性等^[23,25]，这里不再赘述。

　　尽管有很多实验室筛选出了能够走4S途径降解DBT的细菌，他们接下来的工作则有很大差别。有的致力于研究4S途径关键酶系表达的基因调控等方面的分子生物学及酶学研究，有的研究细菌脱硫的传质过程，有的专注于有高效脱硫能力的基因工程菌的开发，也有的将脱硫菌运用于实际脱硫工艺的研究。

　　3 “4S”途径的分子生物学及酶学研究进展

　　美国能源生物公司（ENBC）对紫红红球菌 Rhodococcus rhodochrous IGTS8脱硫过程中C-S键的断裂机理开展了深入研究，证明该过程是由四个关键酶的顺序催化作用完成的^[26-28]，且编码酶的相应基因也已经找到并申请了专利^[29]。

　　4S途径的4个关键酶被确定以后，有学者进行了大量的分子生物学方面的研究。包括改变脱硫基因表达的拷贝数提高表达效率，同时将脱硫的活力也提高了2~3倍^[30]；在表达dszABC基因的同时共表达编码NADH : FMN氧化还原酶的dszD基因，因为它的表达并不和dszABC基因有紧密联系^[31]，这样加快了FMNH₂的再生，提高了脱硫效率^[32]，或者使用其他的氧化还原酶来代替DszD酶^[33]等。

　　酶学方面的研究也取得了很大进展。1997年，Ohshiro等^[34]从走4S途径降解DBT的红平红球菌Rhodococcus erythropolis D-1中分离纯化出了DBT降解第一步反应的酶（系），它们将DBT转化为DBT砜。并结合DEAE-Sepharose两个柱的气相色谱片段检测酶的活性。从Rhodococcus erythropolis D-1中分离纯化出来的这种酶，分子量为250 ku，由6个亚基组成，每个亚基大小为45 ku，经分析20个残基的氮末端氨基酸序列发现，该酶是dszC基因表达的产物。这种酶的最适温度和pH分别为40℃和8.0。他们还发现，降解DBT的酶表现出较高的底物特异性，它能作用于一些DBT的衍生物，却不作用于咔唑、芴等DBT相似物（图2），同时，酶的活性受1，10-邻二氮杂菲、2,2’-联吡啶、8-对苯二酚等及Mn² 、Cu² 、Zn² 的抑制，说明硫醇类物质和金属可能对酶的活性是十分重要的。

　　图2 DBT及其相似物

　　1999年，Ohshiro等^[35]从Rhodococcus erythropolis D-1分离提纯得到了DszA，它能在黄素还原酶的存在下切断DBT骨架中的C—S键。通过离子交换柱色谱获得了4种酶的片段，DszA进一步被纯化出来。这种酶的分子量为97 ku，由两个50 ku的相同亚基组成。除了氮末端的一个蛋氨酸残基外，该DszA的氮末端氨基酸序列与从Rhodococcus erythropolis IGTS8的dszA基因推倒出来的序列完全吻合。这种酶的最适温度和pH分别为35℃和7.5。同时酶的活性受Mn² 、Ni² 、2,2’-联吡啶和8-对苯二酚抑制，说明金属可能参与了酶的活性。

　　2001年，Matsubara等^[36]纯化出了Rhodococcus erythropolis D-1中的黄素还原酶（Flavin reductase），它在DszC和DszA这两个单加氧酶的反应中起重要作用。这个酶不含发色的辅基，分子量为86 ku，有4个相同的分子量为22 ku的亚基。它的最适温度和pH分别为35℃和6.0。在80℃下热处理30 min后，这种酶还有原先30%的活性。这种酶的氮末端氨基酸序列同Gray等^[27]分离出的Rhodococcus erythropolis IGTS8的DszD是相同的。但是这种酶以FAD做底物时反应效果并不是很好，以NADPH做底物则根本不反应。Ohshiro等^[37]在2004年从嗜热杆菌Bacillus sp. DSM411中分离出的黄素还原酶，不仅仅可以FMN和NADH为底物，而且也可与其他黄素化合物反应，同时少量作用于芳香族含氮化合物和NADPH。该酶是目前发现的最嗜热的，热稳定性也是最好的。

　　DszB由Nakayama等^[38]2002年从Rhodococcus erythropolis KA2-5-1中分离出来。该酶的最适温度和pH分别为35℃和7.5。它只有一个半胱氨酸残基，当该残基被丝氨酸取代是，酶的活性丧失。结合抑制剂实验的结果发现，酶的活性中心是半胱氨酸残基。他们还发现，DszB的活性受产物2-HBP及其衍生物抑制，但是并不被另一产物硫酸盐所抑制。DszB的特别之处在于它能够不需要其他蛋白质成分或是辅酶的帮助，切断HBPSi的C—S键生成2-HBP和SO₄^2-。不过这种酶也有很高的底物特异性，在芳香族和脂肪族的磺酸盐和亚磺酸盐中，除了HBPSi之外，只有2-联苯亚磺酸盐（2-phenylbenzene sulfinate）可以作为其底物。

　　4 脱除煤中有机硫的工艺

　　微生物脱除煤中黄铁矿的工艺研究已经很多。20世纪70年代末，微生物脱有机硫的研究陆续有报道以后，也有人进行了工艺方面的研究。1985年，大西洋研究公司（Atlantic Research Corporation）的Isbister和Kobylinski ^[39]从土壤和煤矿样品中分离出恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的突变体CB1，它能在以苯甲酸酯为唯一碳源和能源及高浓度DBT的培养基中生长，在实验室研究中，CB1在停留时间为9~18 h的反应条件下脱除有机硫的效率可达18%~47%。随后他们在一个日处理约1 t煤的小型中试装置上进行试验，反应器为简单的空气搅拌槽，若介质是循环的，细胞密度最小并用可替代的廉价碳源，每吨煤的培养液的成本估计可低至2.34美元。遗憾的是他们后来称CB1相当不稳定且遗失了，因此无从证实CB1菌株的确切代谢途径^[40]。

　　Kitae等^[41]在一个3 L的反应器中，采用Rhodococcus rhodochrous IGTS8处理了3种不同的溶解的煤样，发现生物脱硫与生物溶解作用相结合可以去除75%的全硫，生物脱硫与化学溶解结合则可去除63%的全硫。不过煤的添加量较低，且为溶解处理，工业利用。

　　Kargi等发现嗜热硫化叶菌属Sulfolobus acidocaldarius在70℃下培养28 d后，能脱除煤中的黄铁矿和近19%的有机硫。随后，Kargi等提出一个两步过程，第一段采用Sulfolobus acidocaldarius在温度和pH分别为70℃和2.5的条件下，反应4~6 d脱除黄铁矿；随后，在第二段中用4周左右的时间脱除煤中的有机硫，反应在厚度为0.2 m的浅池中进行。

　　图3 两段法脱除煤中的硫

　　近年来，国外提出一种新的两段式微生物脱硫工艺^[42]，即先用CO₂作为碳源的自养微生物（如氧化亚铁硫杆菌）脱除黄铁矿硫，再通过酸处理溶解干扰生物脱硫的碳酸盐和某些金属离子，这样可以同时增大煤的表面积，使有机煤最大程度地暴露，随后用从外部获得的异样微生物来脱除有机硫，达到最佳效果（图3）。

　　5 问题与展望

　　尽管化石燃料的脱硫方法可以互相借鉴，但是生物法处理煤中的硫比处理石油中的硫难度更大。石油中的有机硫脱除，可以采用常用的连续搅拌槽生物反应器；也可以设计固定化细胞生物反应器，反应后催化剂容易从油中分离回收。而煤由于为固态且单位成本较低，工业应用不可能采用昂贵或是工序复杂的处理方法，这也为工艺的研究开发造成了很大的困难。

　　而现在一般是采用DBT来筛选微生物，煤成分的复杂性并未充分考虑。微生物对煤的结构、热值等的影响，或是煤中的其他成分如重金属离子等对微生物可能的抑制作用，以及微生物的抗毒物能力等都是需要深入探讨的。

　　以DBT做模型化合物筛选出的菌株也并非完美，由于一般代谢途径的终产物会对底物的代谢产生抑制作用，有研究发现几乎每种走4S途径降解DBT的微生物生长都会受到最终降解产物2-HBP的抑制^[27]，2-HBP对微生物的抑制作用是降解DBT的速控步骤^[9]。Nakayama等^[38]发现DszB的活性受产物2-HBP及其衍生物抑制，但是并不被另一产物硫酸盐所抑制。马翠卿等^[23]的实验结果也表明，虽然随着无机硫硫酸盐浓度的增大，红球菌SDUZAWQ的脱硫活力下降，但在硫酸盐在高达1.0 mmol/L后，细菌仍具有脱硫活力，这与文献报道的在较大的无机硫浓度范围内酶的产生完全受阻遏然不同。但是在硫酸根浓度大于10 mmol/L后菌株的脱硫能力受到明显抑制，这与马挺等^[43]，对红球菌DS-3的实验结果基本一致。而煤样是个复杂体系，这些都是亟待解决的问题。日本的Maruhashi课题组就构建了两个基因工程菌Rhodococcus erythropolis KA2-5-1和Rhodococcus erythropolis T09来解决这方面的问题。

　　有机硫的测定方法也并不完善，国家标准方法步骤十分繁杂，且至今仍无法准确测出有机硫的类型和各组分的具体含量以及化学性质，这都在客观上阻碍了脱有机硫方法的发展。目前比较常用的方法是采用电子显微探针（EMP），透射电镜（TEM），X射线吸附精细结构能谱（XAFS）、X射线光电子能谱（XPS）等来获得煤中有机硫的组成及比例方面的重要信息。

　　所以煤的生物法脱除有机硫依然任重而道远。所以，今后的发展应当从以下几个方向入手：（1）要从微生物的生长速率和生长的稳定性、抗毒物能力、解除终产物抑制等方面入手，筛选对煤中有机硫的脱除真正有效的菌株或构建高效的基因工程菌；（2）研究和建立煤中有机硫测定的快速有效的标准方法；（3）开发煤的生物法脱硫有实际应用价值的工艺，可以构建同时具备高效脱有机硫和无机硫能力的菌株，也可有效结合两种高效菌株； （4）脱硫工艺产生的酸性废液的合理回收利用问题，防止二次污染，工艺的装置材质也需要能满足生产条件。

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